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人活性氧 (ROS) 酶聯免疫分析試劑盒使用說明書
本試劑盒僅供研究使用。
檢測范圍：0.3ng/mL - 8ng/mL
規格：96T 貨號：BS-9689-A
使用目的：
本試劑盒用于測定人血清，血漿及相關液體樣本中活性氧 (ROS) 含量。
實驗原理
本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人活性氧(ROS)水平。用純化的人活性氧(ROS) 抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入活性氧 (ROS)，再與 HRP 標記的活性氧 (ROS) 抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏 色的深淺和樣品中的活性氧 (ROS) 呈正相關。用酶標儀在 450nm波長下測定吸光度 (OD 值)，通過標準曲線計算樣品中人活性氧 (ROS) 濃度。
試劑盒組成：
1 | 30 倍濃縮洗滌液 | 20ml×1 瓶 | 7 | 終止液 | 6ml×1 瓶 |
2 | 酶標試劑 | 6ml×1 瓶 | 8 | 標準品 (16ng/mL) | 0.5ml×1 瓶 |
3 | 酶標包被板 | 12 孔×8 條 | 9 | 標準品稀釋液 | 1.5ml×1 瓶 |
4 | 樣品稀釋液 | 6ml×1 瓶 | 10 | 說明書 | 1 份 |
5 | 顯色劑 A 液 | 6ml×1 瓶 | 11 | 封板膜 | 2 張 |
6 | 顯色劑 B 液 | 6ml×1/瓶 | 12 | 密封袋 | 1 個 |
標本要求：
1 ．標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能 馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融
2．不能檢測含NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的 (HRP) 活性。
操作步驟：
1. 標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀 釋。
8ng/mL | 5 號標準品 | 150μl 的原倍標準品加入 150μl 標準品稀釋液 |
4ng/mL | 4 號標準品 | 150μl 的 5 號標準品加入 150μl 標準品稀釋液 |
2ng/mL | 3 號標準品 | 150μl 的 4 號標準品加入 150μl 標準品稀釋液 |
1ng/mL | 2 號標準品 | 150μl 的 3 號標準品加入 150μl 標準品稀釋液 |
0.5ng/mL | 1 號標準品 | 150μl 的 2 號標準品加入 150μl 標準品稀釋液 |
2. 加樣：分別設空白孔 (空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同)、標準孔、 待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣 50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40μl，
然后再加待測樣品 10μl (樣品最終稀釋度為 5 倍) 。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡 量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3. 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘。
4. 配液：將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 倍稀釋后備用5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此 重復
5 次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶標試劑 50μl ，空白孔除外。
7. 溫育：操作同 3。
8. 洗滌：操作同 5。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50μl ，再加入顯色劑 B50μl ，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10 分鐘.
10. 終止：每孔加終止液 50μl ，終止反應 (此時藍色立轉黃色)。
11. 測定：以空白孔調零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度 (OD 值) 。 測定應在加終止
液后 15 分鐘以內進行。
操作程序總結：
計算：
以標準物的濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的 OD 值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD 值計算出標 準曲線的直線回歸方程式，將樣品的 OD 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。
注意事項
1 ．試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未 用完，板條應裝入密封袋中保存。
2 ．濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。
3 ．各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好 控制在 5 分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。
4 ． 請每次測定的同時做標準曲線，最好做復孔。如標本中待測物質含量過高 (樣本 OD 值 大于標準品孔第一孔的OD 值)，請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數 (n 倍) 后再測定，計 算時請最后乘以總稀釋倍數 ( ×n×5)。
5 ． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6 ．底物請避光保存。
7 ．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.
8 ．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9 ．本試劑不同批號組分不得混用。
保存條件及有效期
1 ．試劑盒保存：；2-8℃。
2 ．有效期：6 個月
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